TP53’teki Mutasyonun Elektroforezle Tespiti

P53 geni mutasyonları birçok farklı şekilde tespit edilebilir. Bununla ilgili bir miktar bilgi TP53 Geni yazımızda bahsetmiştik. 2006 yılında Nikoshkov ve Hurd, Real Time PCR kullanarak insan beyni bölgelerinde 8 adet yeni P53 transkripti tespit etmişti.

Bunun dışında 12 exondan oluşan ve 20 kb’lik TP53 geni, meme karsinomalarında mutasyonları tespit etmek için aşağıdaki aşamaları içeren metot kullanılmış ve sonuç olarak başarı elde edilmiştir.

TP53 Mutasyon Tespit

• Çalışmada meme kanseri tanısı konulmuş 20 olguya ait parafine gömülü tümör doku örnekleri kullanıldı.
• Dokulardan alınan 2 µl’lik 10’ar kesit alındı.
• Kesitlere ksilen-tuz uzaklaştırma yöntemi uygulandı.
• Elde edilen DNA’nın saflığını tayin etmek amacı ile spektrofotometrik ölçüm yapıldı.

Bu aşamaların ardından;

TP53 5. Exon Amplifikasyonu İçin

• 94ºC ‘de 7 dakika ilk denatürasyon (35 Döngü)
• 94ºC ‘de 1 dakika denatürasyon, 55ºC ‘de 2 dakika bağlanma
• 72ºC ‘de 2 dakika uzama ve ardından 72ºC ‘de 7 dakika son uzama

TP53 7. Exon Amplifikasyonu İçin

• 94ºC ‘de 7 dakika ilk denatürasyon,
• 94ºC ‘de 1 dakika denatürasyon, (35 döngü)
• 55ºC ‘de 1 dakika bağlanma
• 72ºC ‘de 2 dakika uzama ve ardından 72ºC ‘de 7 dakika son uzama

 

397 bç (Baz Çifti) uzunluğunda olan exon 5 ve exon 6’ya ait primerler birlikte dizayn edildiği için exon 5’in amplifikasyonu exon 6 ile birlikte meydana gelmiştir. Exon 7 ise ise 110 bç uzunluğundadır. PCR uygulaması sonucunda, amplifikasyon ürünleri %2’lik agaroz jel elektroforezi ile Haelll Marker kullanılarak kontrol edildi. Exon 5 ve 6’ya ait 397 bazlık PCR ürünleri yalnızca 5. exona spesifik olan 175. kodonda yer alan CGC sekansını tanıyan Haell enzimi ile muamele edildi. Ardından yine aynı şekilde bu sefer 7. exonda yer alan 249. kodondaki GGCC sekansını tanıyan Haelll enzimi ile muamele edildi.

Bu muamele işlemleri için;

• 1 µl enzim
• 1 µl 10x M Tamponu
• 8 µl PCR amplifikasyon ürünü
• 0,2 ml’lik steril ependorf tüpüne konulduktan sonra, 1 saat boyunca 37ºC’de etüvde inkübasyona bırakıldı.
• İnkübasyon sonunda ise 10x yükleme tamponu ile beraber enzim aktivitesine son verildi.

5. ve 6. exonlar %2’lik agaroz jel elektroforezinde yürütülürken, 7. exon %10’luk poliakrilamid eşliğinde yürütüldü. Ardından yürüme sonunda analiz için UV ışık altında incelendi.

• 5. exonda Haell enzimi ile muamele sonucunda, mutasyon olmaması halinde 163 ve 234 bazlık iki parçaya ayrılması, mutasyon olması halindeyse enzimin o bölgeyi tanıyamaması ve doğal olarak kesmemesi beklenir.
• 7. exon için incelenen amplifikasyonun poliakrilamid elektroforez sonucunda, Haelll ile muamele edilmesi ile beraber mutasyon olmaması halinde, 75 ve 35 bazdan oluşan iki parça görünmesi, mutasyon olması halindeyse enzimin o bölgeyi tanıyamaması ve dolayısıyla kesmemesi beklenir.